歐盟內分泌干擾評估進展激進：內分泌干擾物的識別是當前全球化學品安全性評估中關注的重點,尤其是歐盟在2018年針對農藥與消殺產品的內分泌干擾物評審正式啟動后,已有多個活性物質(如代森錳鋅等)因為內分泌干擾效應無法被排除而被歐盟禁用。同時隨著CLP修正案(Regulation (EC) No 1272/2008)的進一步實施,歐盟也已將內分泌干擾物的識別要求進一步拓展到了一般化學品。

01

美國內分泌干擾物識別進展緩慢

雖然美國環境保護署(US EPA)早在1998年就推動基于兩階段的體外和體內試驗內分泌干擾物識別項目(EDSP),但在實際法規應用和實施方面美國則顯著落后于歐盟。

而EDSP難以推進的主要原因在于：花費巨大。

據統計每個化學品僅完成第一階段的試驗內容預計花費就高達百萬美元,而其中絕大部分費用的支出都集中在體內試驗項目中。

EDSP兩階段的內分泌干擾物識別試驗指南：

(圖片源自：US EPA)

02

新途徑技術方法(NAMs)首次明確可用于內分泌干擾物識別

因此US EPA在十幾年間都聚焦于體外高通量篩選、in silico等新途徑技術方法(NAMs)的研發,建立了相應的數據庫和計算模型來嘗試替代之前EDSP第一階段所需要的高昂試驗資料。

但為了滿足法規應用目的,這些NAMs能否直接用于第一階段的內分泌干擾活性評估必須得到充分的確認,US EPA在系統衡量了穩健性(strengths)、局限性(limitation)和不確定性(uncertainties)后最終明確了兩種NAMs可以用于替代EDSP第一階段雌激素和雄激素受體信號通路所需的試驗資料。

兩種可用于替代EDSP第一階段試驗的NAMs：

03

NAMs的成功應用依賴于海量數據獲取與可靠模型開發

這兩種經充分評估的NAMs成功應用均得益于前期由US EPA等機構主導進行的ToxCast/Tox21項目,ToxCast/Tox21項目依托于細胞體外高通量篩選,采用機械臂進行細胞培養和靶點檢測,其中涉及內分泌干擾相關靶點的檢測納入了數十種細胞系,并能對數千種化合物進行高通量檢測,因而此項目的結果是產生了一個極大的數據集。

Tox21項目中所采用機械臂進行細胞操作

(來源：https://tox21.gov/overview/)

為了利用這些數據集來滿足EDSP的替代傳統體內動物試驗的需求,ToxCast/Tox21項目又進一步向數據科學家開放了數據集,來利用這些已產生的大數據開發具有高預測可靠性的模型,由此兩種能滿足法規評估要求的內分泌干擾NAMs最終被成功開發。

基于網絡模型對體外雌激素受體信號通路建模分析

(來源：TOXICOLOGICAL SCIENCES, 148(1), 2015, 137–154)

04

證據權重(WoE)仍是內分泌干擾評估的關鍵

本次US EPA除了明確NAMs可以用于內分泌干擾物篩選,也在配套發布的白皮書中再次強調了需要通過證據權重(WoE)的方式來整合內分泌干擾評估過程中涉及的所有相關數據,這既包括了已經明確的NAMs以及滿足GLP要求的動物體內數據,也應匯總其他試驗結果(如未經明確的NAMs)、(Q)SAR預測、藥代/毒代動力學等各種數據,進而毒理學家能在全面收集和充分評估的基礎上采用WoE的方式進行整合分析,來得出可靠的內分泌干擾物篩選結果。

05

多數農藥品種將受益于NAMs的法規應用

值得注意的是,由于農藥的內分泌干擾效應一直被廣泛關注,因此在ToxCast/Tox21以及EDSP等項目立項之初就已涵蓋了多數農藥品種,對于這些農藥可以優先考慮采用這兩種NAMs來滿足法規登記所需的對雌激素和雄激素受體信號通路相關試驗資料,因此將大大降低農藥申請人在應對美國內分泌干擾評估的周期與費用。

新途徑技術方法(New Approach Methods, NAMs)

為應對實驗技術的轉變,美國環境保護署(US EPA)也提出了一個新概念：新途徑技術方法(New Approach Methods, NAMs),該術語的定義泛指″能夠提供化學物質危害評估和風險評估信息,且有別于傳統動物實驗,更符合3R原則的測試技術方法與它們的組合″。

所以作為一個符合動物福利的新概念,NAMs幾乎囊括了絕大多數的動物實驗替代技術,如虛擬篩選(virtual screening)、(Q)SAR、交叉參照(read-across)、體外細胞實驗、器官芯片(Organs-on-a-Chip, OOC)、有害結局路徑(Adverse Outcome Pathway, AOP)、確定性方法(Defined Approach)、整合測試與評估方法(Integrated Approaches to Testing and Assessment, IATA)等。

這些技術與方法的發展將實質性地促進動物實驗替代。